western blot

1. Western blot
1) 특징
생체 용액에 있는 개개의 단백질 성분을 분리하는 데 기본적인 기술
2) 원리
- 여러 가지 단백질을 포함하고 있는 세포 또는 조직의 추출물을 전기 영동하여 그 속에 들어있는 단백질을 크기 별로 구분한 다음 흡착지에 옮겨 놓고 조사하고자 하는 단백의 항체와 결합시켜 그 단백의 존재 유무와 크기 등을 밝히는 검사이다.
- Western blot은 다른 말로 면역블롯팅(immune blotting)이라고도 부른다.
3) 방법
- 과정 1
  여러 가지 단백질들을 함유하고 있는 혼합액을 SDS가 포함되어 있는 폴리아크릴아마이드겔에서 전기영동하여 단백질들을 크기에 따라 분리하여 나열시킨다.
- 과정 2
  폴리아크릴아마이드겔에 nitrocellulose 또는 nylon 흡착지를 겹쳐 놓고 전기를 걸어 겔속에 있던 단백질들을 흡착지로 이동시킨다. 흡착지를 보합결합 주머니에 넣고 어떤 단백의  항체를 포함한 보합결합 용액과 함께 배양한 후, 다시 그 항체에 대한 항체와 반응시킨다.
- 과정 3
  이 때 이차 항체에는 바이오틴이 결합되어 있어서 아비딘이 결합된 페록시다아제와 반응시키면 아비딘-바이오틴의 강력한 결합력 때문에 항원-일차항체-이차항체의 혼합체는 결국 페록시다아제를 가지게 된다.
- 과정 4
  과산화수소와 발색제를 함유한 반응액으로 처리하게 되면 페록시다아제에 의하여 과산화수소가 분해될 때 발생하는 발생기 산소는 발색반응을 일으키고 흡착지 위에 존재하는 단백질은 띠모양으로 나타나게 된다.

4) 용도
어떤 단백이 일정한 세포 속에 발현되고 있는가를 확인하거나 그 발현되는 단백질의 크기 변화를 관찰하는 데 이용된다.
5) 단계
Antigen-Antibody reation을 이용하여 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정단백질을 찾아내는 기법으로서 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으킴으로써 특정단백질의 존재여부를 밝혀낸다. Western blotting은 ELISA에 비해 명확한 테스트이며, 각각의 바이러스의 단백질을 직접적으로 대항하는 항체를 시각화할 수 있게 한다. 따라서 이 방법은 양성 HIV ELISA를 확인하는 테스트로 이용된다.

- 첫 번째 단계
  분석하고자 하는 단백질을 SDS-PAGE에 걸어 크기별로 분리한다. SDS-PAGE단계에서는 단백질이 고유한 3차 구조를 잃고 linear 상태가 되어 순전히 분자량에 따라 분리가 된다. 분자량에 따른 분리는 전기영동시 glycine과 Tris-HCl에 의한 수소 이온농도 구배를 가져서 단백질이 가진 음전하량에 따른 이동에 의한 것이다.
- 두 번째 단계
  nitrocellulose, PVDF 및 nylone membrane 같은 filter에 trasfer하는 방법이다. 이렇게 transfer하는 동안 단백질로부터 SDS가 제거되고 단백질의 구조가 재생되면서 본래의 항원 결정기를 가지게 된다. Transfer되는 과정 동안 이동 효율은 분자량에 달려 있는데 분자량이 작은 단백질은 큰 단백질에 비해 효율성이 떨어진다. 이것은 메탄올을 처리함으로써 소수성 결합을 강화시켜 membrane에 잘 결합하도록 한다.
- 세 번째 단계
 원하는 단백질을 Fluorescence (FITC: Fluorescein isothiocyanate), Radioactivity, Enzyme (peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, glucose oxidase) 등을 이용하여 확인할 수 있다. Enzyme 반응을 이용하여 원하는 단백질을 확인하고자 할 경우 antigen-antibody complex는 secondary antibody에 연결되어 있는 horseradish peroxidase (HRPO) 또는 alkaline phosphatase 효소와 이 효소의 기질로서 chromogenic substrate (BCIP, NBT) 또는 luminescent substrate를 이용하여 반응시킨다.