멸균법

미생물 실험은 적당한 배지를 준비하여, 목적으로 하는 미생물만을 순수 배양한 동일 집단을 가지고 연구한다. 주위에는 다양한 미생물들이 존재하고 있으며, 이것들이 배지에 오염되어 자라게 된다면 실험하고자 하는 미생물에 의한 결과를 얻을 수 없다. 따라서 배지는 미생물을 배양하기에 앞서 배양기 내의 모든 미생물들을 사멸시키거나 제거하여야 한다.
이러한 과정을 멸균이라고 한다.

2. 멸균법의 종류

화염 멸균법

백금이나 백금선 또는 시험관이나 플라스크의 입 언저리와 같이 불꽃에 직접 접촉하여도 안전한 물건에 묻어 있는 미생물을 불꽃으로 태워서 죽이는 방법을 화염멸균이라 한다.
미생물을 하나의 배지에서 다른 배지로 옮겨 접종하거나 도말할 때 사용하는 백금선이나 백금이()는 일반적으로 지름 0.7-0.8mm의 백금선으로 되어 있다. 그러나 백금선 대신 전열기용 니크롬선을 사용하기도 한다.
백금이나 백금선은 사용 전과 사용후에 반드시 불꽃의 외염에 45-50각도로 밀어 넣어 전체가 붉게 변할 때까지 가열하고, 이어서 금속으로 되어 있는 백금이대의 약 반 정도까지 천천히 화염에 통과시켜 멸균한다. 백금이나 백금선에 균이나 배지 등이 많이 묻어 있는 것을 바로 외염에 접촉시키면 균이 튀어 오염될 염려가 있으므로 이럴 때에는 내염에 먼저 접촉시킨 후 천천히 외염으로 옮겨 멸균한다.
시험관이나 플라스크의 입 주변의 균은 솜마개를 뽑은 직후와 솜마개를 막기 직전에 입 주변을 가볍게 외염에 통과시켜 멸균한다. 이때 입구를 갑자기 강하게 가열하면 유리가 깨어지므로 주의를 요한다.

건열 멸균법

건열멸균은 주로 유리기구 등과 같이 고온에 안전한 물체를 멸균할 때 사용하는 방법이다. 즉, 멸균 대상물체를 건열멸균기에 넣고 160정도에서 1시간 30분내지 2시간 가열하여 멸균한다. 이 때 멸균기의 문을 열어 유리기구를 급격히 냉각시키면 파손될 경우가 많으므로 건열멸균기의 전원을 끄고 온도가 100이하로 떨어질 때까지 방치하였다가 문을 열어 냉각시키는 것이 바람직하다.

습열 멸균법 ( 자비, 고압증기, 저온, 초고온 멸균법 )

습열멸균은 멸균하고자 하는 물체를 끓는 물이나 증기로 멸균하는 방법이며 건열멸균에 비하여 낮은 온도와 짧은 시간 내에 멸균이 가능하다. 습열멸균에는 자비소독, 간헐멸균, 고압증기 멸균 등이 있다.

자비소독은 주사기, 주사침 또는 핀셋등을 끓는 물에 넣어 최소한 20분간 가열하는 방법이다. 이 방법으로는 포자가 죽지 않고 살아 남을 수가 있어서 멸균이란 말 대신에 소독이란 말을 사용한다. 1회의 자비 소독으로 사멸되지 않은 포자를 죽이기 위하여 간헐멸균을 실시하기도 한다. 즉, 간헐멸균은 자비 소독으로 죽지 않은 포자를 실온에 24시간 방치하여 열에 약한 영양체로 발아시킨 다음 이것을 끓는 물로 20분간 멸균하는 것을 3일간 반복하여 포자까지 완전하게 죽이는 방법이다.

고압 증기 멸균법은 고압증기 멸균기(autocalve)에 멸균할 물체를 넣고 밀폐하여 1kg/cm2
(15lb/in2)의 증기압(121C)에서 15-20분간 처리하여 멸균하는 방법이다. 이때 주의 해야 할 사항은 고압증기멸균기 내에 들어 있는 공기를 100% 의 수증기로 교체한 후 배기발브를 닫아 멸균하는 것이다 왜냐하면 공기가 혼입된 수증기는 같은 압력(15lb/in2)하의 100%수증기보다 온도가 낮아 효과적인 멸균을 기대할 수가 없기 때문이다. 주의하여야 할 또 다른 한 가지는 액체배지와 같은 액상물질을 이 방법으로 멸균한 후 급작히 배기발브를 열어 15lb/in2의 압력을 대기압으로 내리면 액체가 끓어 넘치게 되므로 끓어 넘치지 않도로 배기발브를 서서히 열어서 압력을 내려야 한다.
이 방법은 짧은 시간에 1회의 멸균으로 포자까지 사멸시킬 수가 있으므로 배지와 기구등의 멸균에 널리 사용되고 있다.

여과 멸균법

열에 의하여 파괴되거나 변질되는 액상 물질을 여과기에 통과시켜 미생물을 분리 제거하는 방법을 여과멸균이라 한다. 이것은 미생물을 죽이는 것이 아니므로 여과법이라고도 한다.
여과기의 종류에는 규조토로 만든 Berkefeld여과기, 카올린(Kaolin)과 규사를 혼합하여 만든 Chamberland여과기, 석면으로 된 여과판을 사용하느 Seitz여과기와 최근에 널리 이용되고 있는 아세트산 셀룰로오스(cellulose acetate) 또는 질산셀룰로오스(cellulose nitrate)로 된 인공여과막을 이용하는 여과기가 있다. 멸균에 사용되는 인공여과막의 구멍의 크기는 지름이 0.22 m인 것이 많이 사용된다. 여과기를 흡인병에 연결하고, 흡인병의 옆 가지에 탈지면으로 채운 칼슘관을 고무관으로 연결한 다음, 이 부분과 여과기를 황산지나 알루비늄 박지로 싸서 고압증기 멸균한다. 멸균된 여과장치에 연결된 고무과을 진공펌프에 연결하여 액상물질을 여과하면 균을 완전히 제거할 수 있다.

자외선 멸균법

자외선은 200-380nm의 파장을 갖는 빛을 말하며 살균력을 나타내는 파장은 254nm부근의 자외선이다. 자외선에 의한 멸균은 조작이 간편하고 용이하나 투과력이 약하므로 실험실이나 무균실 또는 수술실의 공기나 실험대의 표면을 멸균하는 목적에 많이 사용된다.

화학적 멸균법

화학적 멸균은 화학약품으로 멸균하는 것을 말하며 이에 사용는 화학약품의 종류는 대단히 많다.
화학적멸균은 열에 쉽게 손상맏는 물체 또는 멸균할 물체의 양이 많거나 큰 물체, 예컨대 플라스틱,종이,목재,병실,선박,집 등에 사용한다. 전에는 화학적 멸균에 포름알데히드가 광범위하게 사용되었으나 오늘날에는 산화 에틸렌(CH2)2O)이 많이 쓰여 지고 있다. 산화 에틸렌은 10.8C에서 액체로 되고 상온에서 기체로 되어 구석구석까지 스며들 수 있으므로 완벽한 멸균을 손쉽게 할 수 있다. 산화 에틸렌은 인화성이 강하므로 사용할 때는 CO2 90%, 산화 에틸렌 10%의 비율로 혼합하여 밀폐된 공간에서 실시하여야 한다. 이것의 처리시간은 미생물의 오염정도와 물체의 양과 크기에 따라 다르나 대체로 4시간에서 하루밤 동안 처리한다.

(1) 크레졸 비누액 : 보통의 세균과 결핵균에 효과가 있으나, 아포나 바이러스에는 효과가 없다.
(2) 계면 활성제 : 역성비누와 양성계면활성제가 있으나 양자 모두 아포에는 효과가 없다. 또 바이러스에 대해서는 종류에 따라 효과가 일정하지 않다. 역성비누는 결핵균에 효과가 있으나 양성계면활성제는 효과가 없다.
(3) 할로겐계 소독제 : 표백분, 차아염소산나트륨 등의 염소계와, 요오드와 계면활성제등의 혼합물이 있다. 유리염소로 살균하는 염소계는 세균,아포,바이러스에는 효과가 있으나, 결핵균에는 효과가 없다. 요오드계는 거의 모든 미생물에 효과가 있다.
(4) 알코올류 : 에탄올(에틸알코올)과 이소프로판올(이소프로필알코올)이 있으며, 에탄올은 70%용액이 사용된다. 결핵균을 비롯하여 거의 모든 세균,바이러스,리케차에 효과가 있으나, 아포에는 효과가 없다.
(5) 가스상태로 작용하는 것 : 포름알데히드 및 에틸렌옥시드가 사용된다. 포름알데히드가스는 포르말린액을 가열하거나 포르말린액에 과망간산칼륨을 투입하여 얻는 것으로, 병실의 훈증 등에 이용된다. 에틸렌옥시드가스는 에틸렌옥시드의 끓는점이 낮기 때문에 비교적 저온에서 작용시킬 수 있고, 가스의 발산도 빠르다. 살균 효과가 포름알데 히드가스보다 강하기 때문에 열과 습기 등에 약한 물건의 소독에 적당하다. 양자 모두 아포,바이러스,결핵균을 포함한 모든 미생물에 효과가 있으며, 요즈음에는 특히 많이 이용되고 있다.
(6) 기타 : 생석회(석회유 등)는 값이 매우 싸고 입수하기가 쉽기 때문에 수로(),하수구,건물 등의 옥외소독에 사용된다.

3. 배지(Culture Medium)의 정의

미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위해 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하여 다시 고화, 그 밖의 목적을 위한 물질을 가한 것, 배양기라고도 한다.
생물은 생존,발육에 필요한 물을 비롯하여 영양물질로서 다량요소, 미량요소등을 요구한다. 그 중 개체상으로 얻어지는 것을 제외하고는 모두 무기 또는 유기화합물로서 배양액에서 공급해주어야한다. 어떤 화합물이 필요한가는 독립영양,종속영양등 영양형식에 따라 여러가지다. 보통 영양원을 탄소원, 질소원, 무기염류, 발육인자등으로 나누어서 생각한다. 특히 발육인자와 관련하여 생물체 내에서 추출한 비교적 복잡한 조성을 가진 것을 주체로 한 것을 천연배지라 하며 세균은 육즙,혈청등 곰팡이는 맥아 엑스등이 흔히 사용된다. 이에 대하여 무기염류만 또는 맥아 엑스등이 아닌 탄소원 질소원을 가한, 조성이 명확한 경우를 합성배지라 한다. 대량 배양에는 액체배지가 적절하고 주의보존이나 분리에는 한천,젤라틴등을 가한 고형배지 사용.

4. 배지의 조성 및 종류

적당한 영양분과 환경조건을 마련하여 줌으로써 많은 종류의 미생물들을 실험실내에서 인공적으로 기를 수 있다. 미생물이 자라 수 있도록 인공적으로 만든 영양 물질의 혼합물을 배지(culture medium)이라 한다.
미생물 세포를 구성하고 있는 원소를 살펴보면 C, H, O, N, P, S, K, Mg, Fe, Ca등과 같이 대량 함유되어 있는 원소와 Co, Ni, Zn, Cu, Mo, Na 등과 같이 극미량 함유되어 있는 미량원소가 있다. 따라서 미생물은 이러한 원소로 되어 있는 화합물을 양적 차이는 있으나 모두 영양원으로 요구한다. 그러나 미생물이 요구하는 원소일지라도 그 화합물의 형태는 미생물의 종류에 따라 다르다. 무기물로부터 유기물을 합성할 수 있는 능력을 가진 독립영양체(autotroph)는 영양원으로서 무기화합물을 요구하고, 무기물로부터 유기물을 생합성할 능력이 없는 종속영양체(heterotroph)는 유기화합물을 영양원으로 요구한다. 또 같은 독립영양체이거나 종속영양체일지라도 미생물의 종류에 따라서 에너지원, 탄소원, 질소원, 무기염류 및 생장인자에 해당하는 화합물의 종류를 각각 다르게 요구한다.
독립영양체는 에너지원과 탄소원으로서 빛, Fe, Fe2+, S, S2O32-, NH3, NO2-, CO, CO2등을 요구하나 종속영양체는 각종 유기산을 비롯하여 알코올, 단당류, 다당류등을 요구한다.
질소원으로는 질산, 아질산, 암모늄염과 같은 펩티드와 같은 유기질소원이 사용된다. 유기질소원으로는 각종 단백질을 산이나 알칼리 또는 효소로 가수분해하여 얻어지는 폴리펩티드, 디펩티드, 아미노산 등의 혼합물이 많이 사용된다. 가수분해물은 그 원료가 되는 단백질성 물질의 순도와 질 및 가수분해하는 방법에 따라 그 질이 달라진다. 산이나 알칼리로 단백질을 가수분해하면 재료에 포함되어 있던 모든 비타민과 일부 아미노산이 파괴되지만, 가수분해효소로 가수분해하면 이들이 파괴되지 않는다. 예컨대 순수한 카제인(casein)에는 탄수화물이 들어 있지 않고 트립토판(tryptophan)이나 비타민의 함량이 높은데 반하여, 이것을 산가수분해하여 얻은 카사미노산(casamino acid)에는 트립토판과 비타민이 전부 파괴되어 존재하지 않는다. 따라서 카사미노산은 비타민 정량용 배지의질소원으로 사용된다. 카제인을 트립신이나 판크레아틴(pancreatin)으로 가수 분해하여 얻은 트립톤(trypton)이나 카시톤(casiton)에는 비타민과 트립토판이 파괴되지 않은 채 잔존하므로 각종 당에 대한 발효시험이나 인돌(indol)시험 등과같은 생화학적 실험을 위한 배지의 질소원으로 사용된다. 같은 목적으로 사용되는 유기질소원으로는 젤라틴을 효소로 가수분해하여 만든 펩톤이 있는데, 이것은 트립토판이 함유되어 있지 않다. 이에 반하여 우유, 육류, 콩, 효모등으로 만든 펩톤에는 탄수화물을 비롯한 각종 비타민과 기타 영양물질이 함유되어 있으므로 당의 발효시험이나 인돌시험 등과 같은 생화학적 시험용 배지에 질소원으로 제공될 수는 없으며 단지 미생물의 증식용 배지에만 사용된다.
무기염류로는 K, Na, Mg, Ca, Fe등의 인산염, 황산염, 염화물 등이 주로 사용되나 이외에도 Mn, Co, Zn, Mo, Cu 등의 미량원소도 염의 형태로 공급되어야 한다.
미생물들 중에는 특정한 아미노산, 비타민, 푸린, 피리미딘, 지방산 등과 같은 물질을 생장인자로서 미량으로 요구하는 것이 있다. 이를 충족시켜 주기 위하여 순수한 특정 아미노산이나 비타민 등을 배지에 첨가하기도 하나, 대개의 경우 여러 가지 생장인자가 모두 포함되어 있는 물질, 즉 육즙, 효모즙, 염통이나 뇌즙, 야채즙, 맥아즙 등을 사용한다. 좀 더 까다로운 영양물질을 요구할 경우에는 혈청, 혈액, 복수와 같은 조직액을 첨가하거나, 살아 있는 세포에 접종하여 배양하기도 한다.
배지의 종류는 구성 성분, 성질, 실험의 목적에 따라 여러가지고 구분한다. 미생물이 요구하는 모든 필수 영양소를 그 조성에 따라 순수한 화학약품으로 만든 배지를 합성배지(synthetic medium)라고 하고, 동.식물의 조직이나 기관 또는 미생물체의 가수분해 산물이나 추출물을 시약과 혼합하여 만든 배지를 복합배지(complex medium)라고 한다. 복합배지는 정확한 배지성분의 조성을 모르기 때문에 증식용 배지로 많이 사용된다.
실험의 목적에 따라 배지를 선택배지(selective medium), 성상확인배지(differential medium), 증균배지(enrichment medium)로 구분하기도 한다. 선택배지는 배지내 염료나 항생물질 또는 특수 화학물질을 첨가하여 특정한 미생물만 생장하도록 만든 배지이고, 성상확인 배지는 염료나 지시약 또는 특정 화학약품을 배지에 첨가하여 특정한 효소반응이나 그 균의 특성을 쉽게 판별할 수 있도록 만든 배지이고, 증균배지는 화학약품의 첨가나 환경조건의 조정하여 다른 종류의 미생물의 생장은 억제시키고 특정한 미생물의 생장만 촉진하도록 만든 배지이다.
또한 배지는 그 성상에 따라 액체배지, 고체배지 및 반고체배지 등으로도 구분된다. 액체배지는 균체의 증식이나 생화학적 시험 또는 대사산물을 얻는 데 사용된다. 고체배지는 평판배지, 사면배지 및 고층배지가 있는데, 이들은 모두 미생물의 순수분리와 보존용으로 많이 쓰인다. 반고체배지는 운동성 실험과 미생물의 보존목적에 이용되고 있다. 배지의 고형화에 쓰이는 물질로는 한천(agar), 젤라틴(gelatin), 실리카겔(silica gel),계란알부민(egg albumin), 감자 및 혈청 등이 있다. 이 중에서 한천은 배지의 성분변화에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 미생물의 영양원으로 이용되지도 않고 44C이상에서 녹고, 미생물의 생육온도 범위내에서 투명한 겔로 되기 때문에 배지의 고형화 재료로서 가장 널리 사용되고 있다.한천 고체배지는 만들들기 위해서 사용되는 한천의 농도는 계절에 따라 다소 차이가 있으나 대체로 1.5-2.0%이다.
일반적으로 배지는 물에 잘 녹는 물질로 만드나 배지의 조성에 따라서는 금속침전물이 생기는 경우가 있다. 이를 방지하기 위하여 EDTA(ethylenediamin tetraacetic acid)같은 킬레이트제(chelating agent) 를 첨가한다.