전기영동 electrophoresis

전기 영동법의 원리
 전기영동은 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의

전기영동법의 종류

1. 이동계면 전기영동법 (Moving boundary electrophoresis)
 전기영동법은 크게 두 가지 유형으로 구분할 수 있다. 하나는 이동계면 전기영동법으로서, 분리하고자 하는 분자들이 용액 내에 산재해 있는 상태에서 전류를 통하여 용매와 용액사이 또는 용액과 용액사이에 계면을 이루게 하는 전기영동법이다. 이동계면 전기영동법에서 계면의 이동은 용액에다 빛을 통과시키고 그 결과를 사진으로 만들어서 조사할 수 있다. 이동계면 전기이동법은 이론상 매우 복잡하여 결과를 해석하는 데 어려운 점이 많다는 것이 단점이다.

2. 띠 전기영동법 (Zone electrophoresis)
 이 방법에서는 적은 양의 시료용액을 거름종이, 아세트산 셀룰로오스 종이, 폴리아크릴아미드 겔, 한천 겔, 녹말 겔 따위의 지지체에 실은 후 전류를 통하여 주면 시료의 성분들이 점 또는 띠를 이루면서 이동한다. 전기영동그림을 만듦으로써 시료에 있는 성분들을 육안으로 확인 할 수 있고, 또한 광도계를 써서 정량할 수도 있다. 때 전기영동법의 경우에는 실험 목적에 따라 적당한 지지체를 선택하여야 분리를 효과적으로 할 수 있다.
 (1) 거름 종이
 종이는 값이 싸고 사용하기 편리한 지지체이다. 그러나 분리하려는 물질들이 셀룰로오스에 흡착이 잘 되어서 전기영동그림의 띠들 사이의 경계가 선명하지 못한 것이 결점이다.
 (2) 아세트산 셀룰로오스
 이 지지체는 아세트산 셀룰로오스의 히드록시기를 아세틸화한 것으로서 협착성이 약하고 물질을 분리하는 데 시간이 짧다. 성분들이 거름종이에 있어서보다 깨끗이 분리되므로 검출하기가 쉽다. 또 아세트산 셀룰로오스는 여러 용매에 쉽게 용해되므로 빠르고 쉽게 회수할 수 있는 장점이다.
 (3) 한천 겔
 이 지지체는 투명하기 때문에 특히 광도계를 쓰는 측정에 적당하며 사용이 간편하다. 특히 슬라이드를 이용하는 면역 전기영동법에 많이 사용되면 한천 겔에서 아가로펙틴(agaropectin)을 제거한 아가로오스(agarose)는 최근에 DNA, RNA 및 플라스미드 등을 분리하는 데 유용하게 쓰인다.
 (4) 녹말 겔
 이 지지체는 녹말을 가열하여 그 알맹이가 파괴되어 겔이 형성될 때 까지 부분가수분해시킨 것이다. 녹말 겔의 구멍의 크기는 녹말의 종류, 완충용액의 종류 및 pH에 따라 결정되면 분자를 거르는 체의 구실을 한다. 한천 겔을 쓸 경우보다 시료가 많이 필요하고, 분리된 물질을 용출하기 어려운 것이 결점이지만 여러 동질효소(isoenzyme)를 분리하는 데에 널리 사용되고 있다.
 (5 ) 아크릴아미드 겔
 서로 다른 그물조직을 가진 두 가지 아크릴아미드 겔을 포개어 불연속적인 층을 이루게 하여 사용한다. 이 경우 지지체의 그물조직의 구멍의 크기는 아크릴아미드의 농도를 변화시킴으로써 임의로 바꿀 수가 있다. 상층의 덜 촘촘한 겔은 단백질 같은 하전된 알맹이를 농축하는 역할을 하는 치쌓임겔(stacking gel)이므로 이 부분을 통과한 시료는 뚜렷한 때를 형성한다. 아크릴아미드 겔은 성분들의 전하에 따라서 분리할 수 있을 뿐 아니라 분자를 질량에만 의존하는 분리가 가능하다.  오늘날 아크릴아미드 겔은 단백질의 분리, 정제한 단백질의 순도 검정, 단백질의 분자량 측정 그리고 DNA의 염기 결합순서 결정 등에 이용되고 있다. 아크릴아미드 겔 전기영동법은 소량의 시료를 사용하여 단시간에 시료 혼합물을 분리할 수 있는 장점이 있다.

3. 불연속 겔 전기영동법 (Disc-gel electrophoresis)
 불연속 겔 전기영동법은 아크릴아미드 겔을 이용하여 단백질들과 같은 하전된 알맹이가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 띠 전기영동법을 변형한 방법이다. 불연속 겔 전기영동법과 띠 전기영동법과의 중요한 차이점은 두 가지 겔(치쌓임 겔, 분리 겔)를 사용한다는 것과 겔 지지체와 완충용액 탱크에 사용하는 완충계들이 다르다는 것이다. 이 전기영동법을 불연속 겔 전기영동법이라고 부르는 이유는 두 겔계에 사용한 수소 이온 농도, 이온의 세기, 완충용액의 조성 및 겔 농도 등이 불연석적이기 때문이다. 불연속 겔 전기영동법에 사용하는 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드와 N, N,N',N'-테느라에틸렌디아민(TEMED)을 첨가한다.  치쌓임겔은 아크릴아미드의 농도가 더 낮으며, 더 낮은 이온의 세기의 완충용액으로 제조되며, 따라서 pH도 더 낮다는 점에서 분리겔과 다르다. 첫 두 요인들에 의해서 단백질 분자들의 치쌓임겔에서의 이동은 분리겔에서의 이동보다 더 빨라진다. 그 이유는 첫째, 구멍 크기가 더 큼으로써(농도가 작은 겔에서) 이동하고 있는 분자들에 대한 물리적인 저항이 작기 때문이고, 둘째, 이온의 세기가 작으면 전기적 저항이 더 커지고 따라서 전기장의 세기(volts/cm)가 더 커지기 때문이다.
 시료층에 있어서는 세 가지 음이온들, 즉 염하이온, 글리신 및 단백질들이 양극 쪽으로 이동하고 있다. pH8.3에서 글리신의 알짜전하는 염화이온의 전하(-1)의 몇 분의 일이다. 글리신은 염화이온보다 더 크기 때문에 더 많은 저항을 받는다. 이 두 가지 이유로 염화이온들은 글리신보다 더 빨리 이동하려 할 것이다. 그러나 전류, 즉 이온들의 흐름은 게 전체에 걸쳐서 같아야 하므로 모든 이온들은 같은 속도로 움직인다. 그러기 위해서는 전압이 염화이온 부분에 있어서보다 글리신 부분에 있어서 훨씬 더 커야 한다. 이렇게 해서 생긴 전압의 불연속성은 염화이온과 글리신 이온을 분리하게 될 것이다. 염화이온과 글리신 이온의 이동속도의 중간의 속도를 가지는 단백즐들은 글리신 이온과 염화이온이 있는 부분들 사이에 오게 될 것이다. 그뿐 아니라 단백질의 전하/질량비는 글리신 이온이나 염화이온보다 휠씬 작으므로 글리신 이온이나 염화이온 용액들이 지니는 만큼의 전류를 지니기 위해서는 매우 좁은 띠들에 농축되어야 한다. 그래서 단백질의 띠 형성이 시작되게 된다.

4. SDS겔 전기영동법
 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)도 역시 유용한 전기영동법의 한 가지이다. 이 방법은 특히 단백질이 단위체인지 아닌면 중합체인지를 결정할 때와, 소중합체를 구성하는 소단위체들의 수와 크기를 결정할 때 유용하게 사용한다.
 SDS-PAGE는 중성 pH에서 황산도데실나트륨(SDS)과 ?-메르캅토에탄올이 전재하는 조건에서 수행된다. SDS는 단백질과 결합하여 단백질의 규칙적인 삼차구조를 파괴하여 불규칙하고 무작정한 코일구조를 가지게 한다. 만일 단백질이 소중합체일 경우에는 구성 단위체들로 해리시킨 후 불규칙한 코일구조를 가지게 한다. SDS와 단백질과의 이러한 작용은 단백질의 사슬내에 있는 이황화물 다리결합 또는 사슬들 사이의 이황화물 다리결합을 환원시키는 ?-메르캅토에탄올에 의하여 촉진된다. SDS가 단백질과 결합하여 단백질 복합체가 되면 단백질이 지니는 음전하는 SDS가 가진 음이온에 기인되는 것이 대부분이다. 중성 pH에서는 단백질 자체의 전하가 극소화되기 때문에 이 경우에는 단백질이 띠게되는 음전하는 단백질에 결합한 SDS에서 오는 음전하뿐이다. 종류가 다른 모든 단백질들에 대하여 SDS는 단위 무게당 일정한 양(1.4g SDS/g단백질)이 결합하므로 SDS-단백질 복합체는 질량에 대한 전하의 비가 일정하게 된다. 또한 SDS-단백질 복합체는 모두 불규칙한 코일구조를 가지고 있으므로 마찰계수도 동일하다. 그러므로 SDS-단백질 복합체의 전기이동속도는 겔의 체 효과에 의해서만 좌우되며, SDS-단백질 복합체이 크기가 클수록 확산계수가 작아서 이동속도가 작아지게 된다.

5.아가로오스 겔 전기영동법
 아가로즈(agarose)는 갈락토스(galactose)와 겔리듐 아만시 (Gelidium amansii)의 한천(aga -r)으로 부터 유도된 3,6- 안하이드로칼락토스 단위체들 (anhydrogalactose units)로 구성되는 천연의 다당류이다. 겔은 전분 겔과 유사한 방법으로 끓는 물에 건조한 중합체를 넣고 상온 에서 식힘으로써 얻어진다. 전분 겔보다 다공성 구조이며 적절한 강도를 가진다. 아가로즈 겔(agarose gel)에서의 전기영동은 보다 진정한 의미의 전기영동으로써 하전된 분자들은 전기장의 영향에 의해 이동하나 지지 물질에 의해 저지되지 않는다. 아가로즈 겔을 이용한 전기영동은 가장 큰 거대 분자와 그 복합체인 바이러스, 효소 복합체, 지질단 백질(lipoprotein), 핵산(nucleic acid)등의 전기영동에 이용되고 있다.
 DNA를 분리, 정제하여 확인하는 방법으로는 아가로스 겔을 이용하는 전기영동법이 보편적으로 사용된다. 이 방법은 간단하고 소요되는 시간이 짧을 뿐 아니라 밀도, 기울기, 원심분리법으로는 분리할 수 없는 DNA조각들의 혼합물을 분리할 수 있다. 그뿐만 아니라 겔 상에서 DNA는 브롬화에티듐(ethidium bromide)과 같은 형광성 시약으로 처리하면 염색되므로 자외선 하에서 DNA를 직접 관찰할 수 있다. 아가로오스 겔을 통한 DNA의 이동속도는 DNA 분자의 크기, 아가로오스의 농도, DNA의 형태, 전류의 세기, 염기 조성 및 온도 등에 좌우된다.

DNA(or RNA) 전기영동;
 agarose로 만든 gel을 이용합니다. 젤에 핵산혼합물을 loading하고 양 끝에서 전류를 흘려줍니다. 핵산은 음전하를 띠고 있기 때문에 음전극으로부터 양전극으로 이동합니다. 이때 핵산이 젤을 통해 이동하는데, 작은 것은 빨리 가고 큰 것은 천천히 가죠. 이런 원리로 크기별로 핵산을 분리합니다